隨著(zhù)美容護膚品市場(chǎng)的不斷發(fā)展，新的化妝品和美容護膚手段層出不窮，化妝品不良反應及化妝品皮膚病的發(fā)生幾率也逐年增加。國家成立了專(zhuān)門(mén)的監督管理機構和診斷機構對化妝品不良反應進(jìn)行監測，并同時(shí)加強對新研發(fā)化妝品上市前安全性的評估。對一種化妝品的安全性評估主要評價(jià)其是否具有使皮膚致敏和引起過(guò)敏性接觸性皮炎的可能性。目前評價(jià)的方法包括對產(chǎn)品組分結構特性的分析、文獻回顧、動(dòng)物局部淋巴結試驗（LLNA）和人體試驗等。其中，人重復性損傷性斑貼試驗（Human Repeated Insult Patch Test， HRIPT）被認為是證明產(chǎn)品不會(huì )在人體產(chǎn)生不良反應的*可信方法[1]，用于對動(dòng)物實(shí)驗中已經(jīng)判定為無(wú)明顯不良反應水平（NOEL）的物質(zhì)的確證試驗[2]。目前國內很少有報道采用HRIPT進(jìn)行化妝品安全性評估。本文介紹了筆者科室近期進(jìn)行的一項針對常見(jiàn)刺激物及11種受試產(chǎn)品的HRIPT試驗，對如何進(jìn)行HRIPT試驗和結果判讀進(jìn)行闡述。

什么是HRIPT/RIPT?

重復結果斑貼試驗是目前最嚴格的研究。使用產(chǎn)品或原材料后不會(huì )有潛在的刺激或過(guò)敏。使用九組誘導貼片，然后在休息一段時(shí)間后進(jìn)行一組刺激試驗。

Hript 人體反復損傷斑貼試驗（Hript）

測試分為誘導期和刺激期。通過(guò)多次重復測試，我們最終可以判斷受試者是否有紅斑或其他不良刺激反應，測試通過(guò)后會(huì )被亞馬遜審核通過(guò)。

化妝品在使用時(shí)與人體表面直接接觸，如果產(chǎn)品存在問(wèn)題，可能會(huì )引起包括皮膚不良反應。斑貼試驗作為常用的化妝品安全性測試，可以檢測這種潛在可能性，以確?；瘖y品使用安全性。

2.HRIPT/RIPT測試過(guò)程

步驟1

樣品到達實(shí)驗室后，將給受試物一個(gè)獨立的實(shí)驗室測試編號，并記錄批號、樣品規格、贊助商、接收日期和測試請求，并通過(guò)測試日志進(jìn)行驗證。

步驟2

志愿者篩選 根據研發(fā)人員的意見(jiàn)，檢測人員需無(wú)全身疾病或皮膚病病史，否則會(huì )影響檢測結果或增加不良反應風(fēng)險。如果皮膚顏色適合觀(guān)察紅斑試驗，任何皮膚性質(zhì)和任何種族都可以參加，最后選擇53人的研究樣本。

步驟3

測試分為誘導期和刺激期。通過(guò)多次重復測試，我們最終可以判斷受試者是否有紅斑或其他不良刺激反應。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗對象 53名健康自愿受試者，其中男性6名，女性47名。受試者年齡為23～53歲（平均為34.7歲）。排除標準 ①處于懷孕期、哺乳期或分娩半年內；②患有可能干擾試驗結果或增加受試者研究參加風(fēng)險的急性或慢性疾??；③正在口服或外用可能干擾試驗結果的藥物（如糖皮質(zhì)激素、非甾體類(lèi)消炎藥、抗組胺類(lèi)藥物和免疫抑制劑等）；④患有慢性過(guò)敏性皮膚病或近12個(gè)月內被診斷為皮膚腫瘤并接受治療者；⑤在斑貼部位有日曬傷、皮膚顏色不均勻、文身、痤瘡、濕疹、牛皮癬、瘢痕及其他可能會(huì )影響觀(guān)察的皮膚病受試者；⑥試驗經(jīng)過(guò)北京大學(xué)第一醫院倫理委員會(huì )批準，所有受試者知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2試驗材料

1.2.2斑試器 封閉式斑試器 為貼附于封閉式膠帶上的8mm鋁制小碟（北京大學(xué)醫學(xué)部醫學(xué)儀器公司）；半封閉斑試器 為直徑23mm的圓形防過(guò)敏膠帶（Curad Sensitive Skin ， Beiersdorf Inc.， Wilton CT）。

1.3試驗流程[3] 整個(gè)試驗過(guò)程分為誘導期（3周），休息期（2周）和激發(fā)期（1周）三部分，持續時(shí)間為6周。試驗過(guò)程如圖1所示。

1.3.1誘導期 將加有受試物的斑試器用無(wú)刺激膠帶貼敷于受試者的脊柱右側，用手掌輕壓以使之均勻地貼敷于皮膚上，并用標記筆標記斑貼部位，保證誘導階段9次每個(gè)產(chǎn)品都是貼在相同的部位（每周一、三、五進(jìn)行），如圖2所示。持續24h后，囑受試者將斑試器取下，避免搓洗局部。再間隔24h后（即下次斑貼之前，周五斑貼的為間隔48h）觀(guān)察反應。以上步驟共重復9次，持續時(shí)間為3周。

1.3.2 休息期 在誘導期結束后休息10～14天，期間無(wú)任何處理。

2 結果

2.1結果判讀 HRIPT的結果是根據受試者在誘導期和激發(fā)期的皮膚反應綜合判定的。如受試者在某個(gè)樣品點(diǎn)上誘導期早期即發(fā)生紅斑、水腫、丘疹等反應，并在激發(fā)期再次出現同樣等級的反應，表明該受試者在試驗前已被該樣品致敏，記為前致敏狀態(tài)（Pre-sensitization）。如果在誘導期出現輕度反應（1～2分），而激發(fā)期未再現，為該樣品重復刺激造成的刺激反應（Irritation）；如果受試者在激發(fā)期的反應較誘導期明顯增強，表示該樣品在試驗期間誘導出這位受試者的過(guò)敏反應，提示這種產(chǎn)品具有潛在致敏性，記為誘導過(guò)敏（Induction of Sensitization） [5]。

Henderson 和Riley 對HRIPT的結果進(jìn)行過(guò)統計學(xué)推算，假設在樣本量為100的人群中進(jìn)行HRIPT檢測，如果結果為陰性，那么在同樣情況下使用這些產(chǎn)品時(shí)，在人群中產(chǎn)生過(guò)敏反應的幾率*大不會(huì )超過(guò)2.9%[2]。需要注意的是，因為HRIPT是在增加濃度和封閉的情況下測試，實(shí)際使用時(shí)過(guò)敏率更低，根據Hall等[6]的估計，化妝品誘導出皮膚過(guò)敏的概率約為0.09%。因此，HRIPT的陰性結果可以作為確證實(shí)驗來(lái)證實(shí)化妝品的安全性。

3 討論

人重復性損傷性斑貼試驗（Human Repeated Insult Patch Test， HRIPT）自1944年被Schwartz和Peck提出以后，經(jīng)過(guò)不斷的改良，目前已經(jīng)被認為是評價(jià)新材料或消費品對人體致敏性和刺激性的*可信方法。HRIPT在歐美的使用率是*高的，經(jīng)濟與合作發(fā)展組織（OECD）和EU試驗指南中這兩種試驗也是優(yōu)選的方法，??（xxdu2016) 并可以在其他方法獲得數據不足的時(shí)候作為確證試驗[2]。HRIPT具有封閉性，可以模擬并放大人體實(shí)際使用過(guò)程，現已證實(shí)封閉式試驗優(yōu)于皮內注射和開(kāi)放式局部應用的方法，具有足夠的敏感性，能檢測出絕大部分的致敏物[7-8]。

HRIPT在誘導期，每次斑貼持續24h，然后間隔24h或48h讀結果，并進(jìn)行下一次斑貼，可以使前一次斑貼造成的皮膚反應充分顯現。誘導期結束后2周的休息期則使得各種免疫反應可以充分進(jìn)行，并且此時(shí)誘導期的過(guò)敏反應通常都已消失，不會(huì )對激發(fā)期產(chǎn)生干擾。所用檢測物的濃度設定通常建議采用不引起刺激的*高濃度，這個(gè)濃度是從之前人體刺激性試驗、過(guò)敏原測試和人體重復應用試驗中的數據中獲得，有時(shí)還需要結合試驗設計考慮，如對實(shí)際應用中濃度放大數倍或者參照誤用后濃度進(jìn)行檢測。通過(guò)采取劑量依賴(lài)性研究甚至可以了解通過(guò)減少劑量是否能達到安全的使用量，即反應誘發(fā)閾值（response elicitation threshold）[9]。這些特點(diǎn)都使得HRIPT具有更高的敏感性。在本研究中，11種產(chǎn)品在激發(fā)期都沒(méi)有出現陽(yáng)性反應，但在誘導期有1～9人對5種樣品1、4、5、7、12、13和14中出現輕度紅斑反應，提示在實(shí)際使用過(guò)程中，重復外用這幾種化妝品可能具有一定的刺激性。但這個(gè)結果只有通過(guò)HRIPT才能夠發(fā)現，因為傳統的斑貼試驗是單次試驗結果判讀，就會(huì )得到類(lèi)似誘導期的陰性結果。再次證明HRIPT的敏感性和在化妝品安全性檢測中的重要意義。

斑貼試驗的結果受到諸多因素的影響，如稀釋受試樣品的基質(zhì)、樣品濃度、所用樣品的量、封閉方式等都可能影響，產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結果[10-11]。通常情況下，對于乳液、爽膚水等可在皮膚上長(cháng)期駐留的產(chǎn)品可以選擇用未經(jīng)稀釋的原液進(jìn)行斑貼。而對于潔面乳這種洗脫類(lèi)產(chǎn)品，由于在實(shí)際使用中會(huì )被大量的水沖洗掉，選擇用蒸餾水進(jìn)行稀釋?zhuān)?%的稀釋液進(jìn)行斑貼。即使這一濃度也大于實(shí)際使用中人體對這種化妝品的暴露濃度[12]。此外，封閉式斑試器也起到對受試樣品暴露的放大作用。而對于卸妝乳，其油溶性成分含量較高，通過(guò)以油溶油的原理去除彩妝，本身性質(zhì)比較溫和，某些按摩油本身也具有卸妝的作用，可以在面部長(cháng)期駐留。因此需要根據產(chǎn)品本身的性質(zhì)判斷濃度和斑貼方式。本研究中有3種卸妝乳，考慮到放大效應，對3、5號選擇了封閉式斑貼，11號因為含有較多量表面活性劑，與12～14號潔面乳一樣選擇了半封閉斑試器進(jìn)行試驗。結果只有5號有輕度的刺激反應，無(wú)過(guò)敏反應出現，說(shuō)明在實(shí)際應用中是很安全的。

在進(jìn)行多樣品斑貼試驗時(shí)還需要注意激動(dòng)皮膚綜合征， 是由于皮膚對于某個(gè)樣品包括對于斑貼所用的膠帶等產(chǎn)生的強烈反應，可能會(huì )誘導出高激惹狀態(tài)（俗稱(chēng)“激惹的后背”），從而使得其他樣品也出現輕度的陽(yáng)性反應[13]。在本研究中，我們觀(guān)察到一些受試者對試驗用的膠帶或陽(yáng)性對照產(chǎn)生比較強烈的反應，同時(shí)多個(gè)其他樣品點(diǎn)也表現為輕度紅斑反應，可能也受到了激動(dòng)皮膚綜合征的影響，對于膠帶或陽(yáng)性對照的強陽(yáng)性反應也可能增加了樣品刺激反應率。

總之，HRIPT 通過(guò)采用延長(cháng)暴露時(shí)間，采用較高使用濃度和封閉斑貼的方法，達到一種比實(shí)際使用時(shí)的放大效果，并可以檢測出極微弱的刺激反應，提示在實(shí)際使用時(shí)可能出現的風(fēng)險。HRIPT的陰性結果可以證明人體不會(huì )對特定產(chǎn)品或配方產(chǎn)生不良反應。盡管如此，需要注意的是 出于倫理方面的考慮，HRIPT試驗并不用于預測或者篩選鑒定潛在的致敏原，而主要作為確證試驗，在放大應用的條件下來(lái)檢測配方中的過(guò)敏原，保證產(chǎn)品在面對消費者應用時(shí)的安全性。

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